Фотонно-кристаллическое усиление флуоресцентного излучения и подавление мерцания для биосенсирования с цифровым разрешением в виде одной квантовой точки

Nature Communications, том 13, номер статьи: 4647 (2022) Цитировать эту статью

7414 Доступов

20 цитат

15 Альтметрика

Подробности о метриках

Хотя наноразмерные квантовые излучатели являются эффективными метками для измерения биомолекулярных взаимодействий, их полезность для приложений, требующих единичных наблюдений, ограничена требованиями к объективам с большой числовой апертурой (NA), прерывистостью флуоресценции и плохой эффективностью сбора фотонов, возникающей из-за ненаправленного излучения. Здесь мы сообщаем об усилении сигнала почти в 3000 раз, достигнутом за счет мультипликативных эффектов усиленного возбуждения, узконаправленного извлечения, улучшения квантовой эффективности и подавления мерцания через поверхность фотонного кристалла (ПК). Этот подход обеспечивает чувствительность к одной квантовой точке (КТ) с высоким соотношением сигнал/шум даже при использовании линзы с низкой апертурой и недорогой оптической установки. Способность ПК подавлять мигание увеличивает время включения QD с 15% до 85%, уменьшая прерывистость сигнала. Мы разработали анализ биомаркеров микроРНК, связанных с раком, с разрешением одной молекулы, селективностью мутаций по одному основанию и 10-аттомолярным пределом обнаружения. Кроме того, мы наблюдали дифференциальные траектории поверхностного движения КТ, когда жесткость их поверхностного прикрепления изменяется путем изменения одного основания в последовательности специфичной для рака микроРНК.

Флуоресцентные репортеры на основе химических веществ и наночастиц широко используются в биологических исследованиях и молекулярной диагностике. Генерирующие фотоны метки позволяют визуализировать и количественно анализировать биологические аналиты путем присоединения репортера к целевой молекуле с последующим обнаружением с помощью прибора, который возбуждает флуоресценцию и одновременно собирает излучение фотонов в оптический датчик. Коллоидные КТ обладают широким спектром полезных оптических свойств для цифровых анализов с считыванием одиночных молекул, включая большие коэффициенты поглощения (> 107 М–1 см–1), узкие и широко перестраиваемые полосы излучения, высокую фотостабильность и высокую квантовую эффективность. Усиление флуоресцентных репортеров за счет локального увеличения интенсивности электромагнитного поля с помощью плазмонных поверхностей и наноструктур оказалось эффективной стратегией для достижения снижения пределов обнаружения в биомолекулярных анализах1,2,3,4,5,6, особенно для анализов, которые обнаруживают агрегаты многих флуорофоров. , чье излучение объединяется для получения сигналов, которые обнаруживаются выше фоновой флуоресценции и дробового шума фотодетекторов7,8,9,10. Общие стратегии анализа включают агрегирование многих флуорофоров вместе (например, пятно микрочипа) или использование ферментативной амплификации для создания большого количества флуоресцентных репортеров из одного аналита.

В последние годы большое количество исследований было посвящено проблеме усиления возбуждения одиночных флуоресцентных репортеров, эффективного сбора их фотонного излучения и генерации сигналов, которые позволяют их наблюдать в присутствии различных источников шума. Например, флуоресцентная микроскопия с полным внутренним отражением (TIRF) может обеспечить разрешение одного флуорофора за счет использования дорогих масляно-иммерсионных объективов с высокой числовой апертурой и камер с зарядовой связью с электронным умножением (EM-CCD), что обеспечивает более чем 30-кратное увеличение пропускной способности сигнала. -коэффициент шума11, 12. Плазмонные наноструктуры13,14,15,16,17,18 оказались успешными для локализованного усиления интенсивности возбуждения электрического поля с коэффициентом усиления флуоресценции от ~ 100 до ~ 1000, хотя многие плазмонные структуры страдают от высокого не-шума. радиационный распад из-за собственных потерь в металле, тушения и низкой направленности испускаемых фотонов16. Более того, резонансная длина волны таких наноструктур определяется размером, формой и материалом нанорезонаторов. Ранние подходы к возбуждению флуоресцентных репортеров с помощью диэлектрических оптических микрополостей демонстрируют умеренное увеличение скорости излучения19,20,21. Одним из ограничений диэлектрических микрорезонаторов является несоответствие между высокодобротными резонансами резонатора и спектрально широким излучением неоднородно уширенных флуоресцентных излучателей при комнатной температуре. Недавние отчеты об усилении электромагнитного поля с помощью плазмонно-диэлектрических гибридных нанозазоров и диэлектрических нанопроволок-пластиков22 рассматривают эти проблемы и показывают усиление в ~ 1000 раз, но с небольшим количеством сильно локализованных горячих точек, которые редко занимают лишь небольшую часть общей поверхности. область. Тем не менее, для достижения таких высоких коэффициентов усиления за счет сложного нанопроизводства требуется точное согласование между излучателями флуоресценции и модами резонатора. Чтобы преодолеть эти проблемы, в нашем предыдущем исследовании использовался подход на основе микроскопии для усиления флуоресценции поверхности ПК на обширных участках поверхности. Сообщалось о 60-кратном увеличении интенсивности флуоресценции слоя стрептавидина, конъюгированного с Cy-5, на одномерном PC23. Это улучшение можно увеличить до 360 раз, соединив моду утечки ПК с лежащим в основе резонатором типа Фабри-Перо через золотой зеркальный отражатель24. Сообщалось о 108-кратном усилении флуоресценции слоя КТ при использовании экстракции флуоресценции с использованием режима утечки с двумерной поверхности ПК25. Совсем недавно Ян и др. продемонстрировали ПК с множественной гетероструктурой со сверхширокой полосой задерживания для достижения широкополосного усиления флуоресценции более чем в 100 раз26, что потребовало сложного послойного изготовления самоорганизующихся 2D коллоидных кристаллических монослоев. Трехмерные структуры ПК также использовались для усиления флуоресценции. Сонг и др. нанес слой красителя Ru на 3D-опаловые ПК, состоящие из нескольких слоев сфер PMMA, для достижения ~320-кратного усиления люминесценции с конфигурациями с двумя полосами задерживания27.